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Bloqueo de la expresión génica

Actualmente, dos tipos principales de fármacos basados en oligonucleótidos están en desarrollo como plataformas terapéuticas para reducir la expresión del gen de interés: los oligonucleótidos antisentido y los ARN pequeños de interferencia (siRNA, por sus siglas en inglés). Aunque estas plataformas tienen distintos mecanismos moleculares (Figura 1), comparten un principio fundamental: un oligonucleótido se une a un ARN objetivo a través de complementaridad de bases y el dúplex resultante dirige la degradación del ARN mensajero objetivo (ARNm). Otras clases de agentes terapéuticos de oligonucleótidos modulan la función del ARN uniéndose a sitios de empalme del pre-ARNm, lo que resulta - por ejemplo- en la omisión de la mutación dentro de los exones en el caso de enfermedades como la distrofia muscular.

Una característica atractiva de la terapéutica de oligonucleótidos es que representan una aplicación directa de la información genómica en el diseño de fármacos. El concepto es directo: un ARN objetivo es seleccionado, se sintetiza una secuencia oligonucleotídica complementaria, se modula la expresión génica y se examinan los fenotipos. Sin embargo, la realidad es más compleja. En particular, la incapacidad de administrar el fármaco candidato a los órganos y células que están expresando los ARN relacionados con la enfermedad ha demostrado ser el mayor obstáculo para el desarrollo exitoso de agentes terapéuticos.

Como macromoléculas polianiónicas, los oligonucleótidos deben eliminar muchos obstáculos para alcanzar su sitio de acción. Estos deben ser considerados para el desarrollo de un sistema de entrega eficaz. Los oligonucleótidos son considerablemente más grandes que los candidatos a fármacos basados en moléculas pequeñas tradicionales. Su tamaño, junto con su naturaleza altamente aniónica, hace difícil que difundan a través de las membranas celulares para alcanzar el citoplasma y los compartimentos nucleares.

Históricamente, los investigadores han utilizado diferentes estrategias para la administración de oligonucleótidos antisentido monocatenarios y de siRNAs de doble cadena. Los primeros son administrados en una solución salina y son absorbidos por las células del hígado, riñón y partes del sistema reticuloendotelial y en menor medida por otros tipos de células. Esto ocurre mediante endocitosis o unión no específica a proteínas de la superficie celular y por movimiento de los oligonucleótidos por gradientes de concentración en el citoplasma. Los siRNA bicatenarios se han administrado en nanopartículas lipídicas o poliméricas, lo que da como resultado su acumulación en el sistema reticuloendotelial, incluidos el hígado y el bazo. Ambas estrategias de entrega dependen de la unión aleatoria a superficies celulares o extravasación de capilares en el hígado. Aunque son capaces de producir efectos farmacológicos dosis-dependientes, las estrategias son ineficientes, lo que lleva a la excreción renal del fármaco o a su entrega hacia células y tejidos que no son de interés terapéutico.

Figura 1: Incorporación de oligonucleótidos terapéuticos mediada por receptor.

El panel A muestra la administración dirigida de agentes terapéuticos de oligonucleótidos a hepatocitos a través del receptor de asialoglicoproteína (ASPGR). El ASPGR se une e internaliza a la N-acetilgalactosamina triantenaria (GalNAc) conjugada con un oligonucleótido antisentido terapéutico o ARN interferente pequeño (siRNA) (no mostrado), los que se interiorizan y luego se liberan dentro de la célula, donde pueden hibridarse al ARN pre-mensajero e inducir la escisión del ARN-ADN heteroduplex. El panel B muestra la entrega de oligonucleótidos a tipos de células específicas a través de proteínas de la superficie celular. Una proteína específica de la membrana (CD71) se une e internaliza el siRNA conjugado con Fab dirigido contra un gen ligado a una enfermedad. Solamente las células que expresan esa proteína específica de superficie interiorizarán el siRNA. Después de la liberación del siRNA del compartimento endosómico o lisosómico, se puede cargar en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El RISC cargado puede entonces escanear todos los ARN expresados por complementariedad de secuencia. Cuando una secuencia complementaria se detecta por hibridación, una enzima que es parte del RISC escinde el ARNm blanco, reduciendo así la expresión de la proteína relacionada con la enfermedad. RNAi denota interferencia de ARN.

Recientemente, la estrategia para administrar oligonucleótidos ha cambiado de una entrega inespecífica a una selectiva. Este nuevo enfoque aprovecha el potencial de receptores extracelulares para promover la internalización de ligandos unidos a receptor. Los oligonucleótidos se conjugan con una N - acetilgalactosamina triantenaria (GalNAc) que es reconocida por una asialoglicoproteína de alta capacidad expresada en hepatocitos. Los oligonucleótido conjugados a GalNAc ligados a los receptores de asialoglicoproteına son eficientemente internalizados en los hepatocitos, y una vez en el citoplasma (en el caso de siRNAs) o núcleo (en el caso de oligonucleótidos antisentido), pueden modular la expresión del ARN afín (figura 1A). La estrategia mediada por GalNAc conjugada está siendo evaluada en múltiples ensayos clínicos. En uno de ellos, un conjugado de siRNA-GalNAc, permite que la porción de siRNA se dirija a la enzima PCSK9. Esta enzima se une y degrada el receptor de la lipoproteína de baja densidad y es un blanco para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular.

Aunque se han realizado progresos considerables para dirigirse al tejido hepático con los conjugados de GalNAc, sigue habiendo una necesidad de orientarse hacia células no hepáticas específica y eficientemente. Un medio para lograr esta meta podría estar en la explotación de la heterogeneidad natural de los receptores de la superficie celular. Recientemente, Tsukasa Sugo y colaboradores usaron un siRNA conjugado con un fragmento Fab de un anticuerpo para CD71 (receptor de transferrina) para producir reducciones de la expresión génica mediadas por oligonucleótidos, en músculo esquelético y corazón (Figura 1B). Tomando ventaja del hecho de que la expresión de CD71 en células musculares es 5 veces mayor que en las células hepáticas, los autores pudieron reducir la expresión génica en el músculo esquelético y en corazón de una forma selectiva, sin cambios en la expresión génica en el hígado y el bazo. 

En última instancia, el éxito de la entrega dirigida dependerá de las tasas de internalización y del tráfico específico de conjugados unidos a receptores dentro de las células. Sin embargo, la evidencia disponible indica que cantidades suficientes de oligonucleótido puede ser internalizados para producir reducciones significativas en la expresión génica. Estos resultados, junto a la información proporcionada por los estudios clínicos en curso muestran que los fármacos basados en oligonucleótidos están mejorando a medida que se realiza una administración más selectiva.