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Detección de ácidos nucleicos

Durante los últimos 20 años, los grandes avances metodológicos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación del ADN han transformado laboratorios de microbiología y virología clínica. Estos nuevos métodos permiten obtener resultados precisos y un diagnóstico rápido de una amplia gama de enfermedades infecciosas y facilitar el seguimiento de respuestas para el tratamiento de las infecciones, como las causadas por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y citomegalovirus (CMV). Sin embargo, aún existe una importante brecha en el arsenal de diagnóstico: la carencia de pruebas diagnósticas rápidas, fiables, fáciles de usar y económicas que se pueden aplicar en el lugar de atención. Desde hace años se viene demandando este tipo de proyectos de pruebas en áreas con recursos limitados, pero tales pruebas pueden tener importancia en un amplio rango de análisis, proporcionando resultados que pueden afectar decisiones clínicas en tiempo real. 

Para ello, Jonathan Gootenberg y colaboradores (doi: 10.1126/science.aam9321) reprogramaron una endonucleasa que se asocia con CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) en el ADN de procariotas (estas secuencias son parte del sistema inmunitario adaptativo de los procariotas) para lograr una sensibilidad analítica a nivel de molécula individual, para una rápida detección de ácidos nucleicos. Los investigadores explotaron una actividad de la enzima Cas13a llamado "actividad ARNasa promiscua". Una vez que la enzima rompe un objetivo de ARN (como una secuencia específica de virus a la que se guía específicamente por un complemento de ARN), puede unirse y degradar a otros fragmentos de ARN, como los ligados a fluoróforos, los que sirven como reporteros (figura 1). Combinando la detección basada en Cas13a con la amplificación isotérmica del ADN y del ARN objetivos en un solo tubo de reacción, se logra una rápida visualización y detección en tiempo real de objetivos, incluso a bajas concentraciones, y la diferenciación de productos específicos en ARN o ADN.

Para determinar si este método proporciona la sensibilidad y especificidad requeridas para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, los autores diseñaron lentivirus que contenían fragmentos del genoma del virus Zika (ZIKV) y del virus del dengue (DENV). El sistema detectó secuencias ZIKV en concentraciones tan bajas como 2 attomolar (aM) y distinguió diferencialmente a ambos tipos de patógenos, una característica importante para aplicaciones clínicas (figura 2). Los autores entonces exploraron el uso potencial de este método en campo liofilizando los reactivos y posteriormente rehidratándolos.

Figura 1. El mecanismo de SHERLOCK.

La reacción SHERLOCK combina una preamplificación del ADN mediante amplificación por polimerasa recombinasa (RPA) o una preamplificación de ARN con RPA con transcripción inversa con una detección posterior dirigida por Cas13a. Durante la preamplificación, se añaden los promotores de la ARN polimerasa T7 para permitir la transcripción del ADN amplificado a RNA. Este ARN puede ser detectado a través de incubación con Cas13a, ARN CRISPR complementarios y sensores fluorescentes de ARN. Al unirse a una secuencia de ARN objetivo, la enzima Cas13a se activa y rompe promiscuamente otras especies de ARN, fenómeno conocido como efecto colateral. Los sensores de ARN con reporteros fluorescentes en el extremo 5' y una molécula que reduce la fluorescencia (quencher) en el extremo 3' son divididas por Cas13a, generando una señal fluorescente. En ausencia de la activación de Cas13a, no ocurre la escisión del ARN reportero ni la generación de fluorescencia. La combinación de pasos de amplificación y este sistema de detección permite la identificación con especificidad de una sola base en 1 a 2 horas.

El sistema basado en papel para la detección, funcionó pero resultó en una reducción general de señal fluorescente para ZIKV y un ruido más alto para DENV, de forma que la señal de detección se redujo en aproximadamente 1 log10 (20 aM). El rendimiento del método de detección fue también evaluado con el uso de muestras de suero y orina de cuatro pacientes infectados con ZIKV; el test detectó el virus en las cuatro muestras clínicas, con concentraciones de ARN que iban desde 8,25×10e5 copias por mililitro (copias /mL) a 1,25×10e3 (copias /mL) verificado por medio de PCR cuantitativo en tiempo real.Los autores también mostraron cómo el método, SHERLOCK (del inglés specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking), identifica patógenos bacterianos al dirigirse al gen de ARNr 16S, particularmente en la región V3. Comenzando desde una colonia aislada, SHERLOCK pudo detectar Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa y distinguir estas especies de Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, y Staphylococcus aureus. Además, SHERLOCK puede diferenciar fácilmente los aislados clínicos de K. pneumoniae que poseen genes de resistencia a carbapenemasa o a beta lactámicos. Finalmente, la especificidad de SHERLOCK fue mejorada mediante la introducción de cambios sintéticos en la guía de ARN que condujo a la generación de una o más bases desapareadas cuando se hibridan con el ARN objetivo.

Figura 2. Versatilidad en la aplicación.

Los autores mostraron la aplicación de SHERLOCK en varios escenarios. Entre ellos se incluye la detección de una sola molécula del virus de Zika y la distinción de cepas estrechamente relacionadas. Además lograron discriminar diferentes especies de bacterias y detectar genes de resistencia a antibióticos; la determinación rápida del genotipo del paciente y detección de mutaciones relacionadas con el cáncer en el ADN libre de células.

Este ensayo modificado permitió la discriminación de los blancos que difieren en sólo un solo par de bases y distinguió exitosamente las cepas africanas y americanas de ZIKV, diferentes serotipos de DENV, cinco alelos de relevancia clínica desde la saliva, y varias mutaciones relacionadas con el cáncer en suspensiones de ADN libre de células. Esto último representa una de las aplicaciones más potentes de SHERLOCK. También tiene varias características importantes que lo hacen factible para su uso en el punto de atención, dado la velocidad con que se realiza un ensayo en papel pueden diseñarse y sintetizarse (sólo en pocos días), el coste estimado de los reactivos y materiales (menos de $1 por prueba), la estabilidad de los reactivos liofilizados, y la velocidad con que se puede realizar el ensayo (dentro de 1 a 2 horas).

Aunque los resultados descritos son alentadores, se necesita una evaluación más rigurosa de las características de rendimiento del sistema SHERLOCK para cada uno de las aplicaciones. Además, el proceso de comercialización y la introducción de nuevas tecnologías en la práctica clínica es un reto. La prueba tendría que tener características de rendimiento que se asemejan a los actuales métodos de laboratorio utilizados en el análisis clínico para muestras de pacientes y, ser diseñada con la simplicidad necesaria para su uso en el punto de atención por personal clínico ajeno al laboratorio. En el pasado, algunos métodos diagnósticos tradicionales, como el cultivo viral y las pruebas de detección rápida de antígenos, fueron tan limitadas en su rendimiento general que las nuevas tecnologías moleculares se incorporaron rápidamente al uso clínico. 

Sin embargo, actualmente las pruebas deben demostrar que mejorarán la calidad clínica costo-eficacia para obtener la certificación y financiamiento para la realización de estudios pertinentes. Aunque hay una clara necesidad de pruebas rápidas y económicas en el punto de atención, y aunque el entusiasmo por la posibilidad que la tecnología SHERLOCK pueda, tal como ocurrió con la PCR, representar un gran avance en términos de velocidad y la precisión de detección de muchos patógenos microbianos, aún se espera ansiosamente por estudios más detallados para determinar si este innovador método es capaz de llenar el gap de diagnóstico.