En el corazón de la edición génica
La edición del genoma tiene el potencial para corregir selectiva y especÃficamente mutaciones de la lÃnea germinal. Recientes publicaciones han mostrado el avance para reparar una alteración heterocigótica del gen MYBPC3 en embriones humanos mediante el método CRISPR-Cas9, que se respalda en la precisión y alta eficiencia de la activación de una respuesta endógena de reparación del ADN. Los quiebres inducidos en la doble hebra del ADN en el alelo paterno mutante fueron sorpresiva y predominantemente reparados usando el gen materno silvestre homólogo como templado, en lugar de una plantilla de ADN sintético introducido por los investigadores. Utilizando el método, se logró evitar el mosaicismo durante la división embrionaria y se alcanzó un alto rendimiento de embriones homocigotos portadores del gen silvestre sin evidencia de mutaciones fuera de objetivo. La eficacia, precisión y seguridad de este enfoque sugieren que tiene el valor para ser utilizado en la corrección de mutaciones hereditarias en embriones humanos complementando el diagnóstico genético preimplantacional. Sin embargo, aún queda mucho por considerar antes de las aplicaciones clÃnicas, incluyendo la reproducibilidad de la técnica con otras mutaciones heterocigotas.
Reparación silvestre
La capacidad de editar selectivamente regiones del genoma utilizando una técnica conocida como CRISPR-Cas ha transformado muchas áreas de la investigación biológica. Estos avances han planteado la interrogante de si esta técnica se utilizará en el futuro para tratar o prevenir enfermedades. Los ensayos clÃnicos que han usado este método para modificar células humanas ya están en marcha, por ejemplo se han probado células inmunitarias editadas para tratar el cáncer.
Actualmente existe un debate en curso sobre el uso potencial de CRISPR-Cas para modificar el genoma de un individuo, tema que plantea muchos cuestionamientos éticos y reglamentarios. Sin embargo si se llegase a implementar ¿qué otras investigaciones extra cientÃficas debiesen ser necesarias para llegar a aplicarse en la clÃnica? En un reciente artÃculo Hong Ma y colaboradores reportaron el uso de CRISPR-Cas para reparar una alteración genética asociada con la enfermedad cardÃaca, en un estudio de embriones humanos cultivados in vitro. Los autores analizaron minuciosamente los embriones modificados, demostrando que algunos de los obstáculos técnicos asociados a menudo con el uso de esa tecnologÃa de edición del genoma podrÃan ser superados.
La condición conocida como cardiomiopatÃa hipertrófica  es una enfermedad cardÃaca hereditaria. Puede ser causada por mutaciones en muchos genes diferentes, incluyendo el gen de la proteÃna C de unión a  miosina cardÃaca (MYBPC3). Este gen codifica una proteÃna que contribuye al mantenimiento estructural del músculo cardÃaco y a la regulación de su contracción y relajación. La presencia de una copia mutante de MYBPC3 causa sÃntomas que generalmente se manifiestan como insuficiencia cardÃaca. Aunque los tratamientos existentes pueden disminuir los sÃntomas, no hay manera de hacer frente a la causa genética subyacente en un paciente. Hong Ma y sus colegas investigaron el uso de la edición génica para corregir esta mutación.
Una opción para prevenir la heredabilidad de algunas mutaciones asociadas a la condición es utilizar pruebas genéticas durante la fecundación in vitro (FIV) para superar la fertilidad. Esto permite la selección de embriones que no contienen la mutación especÃfica. Si uno de los padres que participan en el tratamiento de FIV tuviera una copia mutante de MYBPC3, el 50% de los embriones fecundados heredarÃan la enfermedad. Los autores propusieron un escenario hipotético en el que su enfoque podrÃa permitir que un individuo con cardiomiopatÃa hipertrófica aumente el porcentaje de embriones disponibles para la implantación de FIV que no heredasen la enfermedad.
En los últimos años, CRISPR-Cas ha sido desarrollado para editar de manera eficiente y precisa el genoma humano. Aunque este método ha sido ampliamente adoptado en sistemas de cultivo de células de mamÃferos y modelos de embriones animales, tan sólo tres estudios publicados reportan el uso de esta técnica en embriones humanos.
El sistema de edición CRISPR-Cas necesita sólo dos componentes para modificar el ADN: una guÃa correspondiente a una secuencia de ARN y una enzima nucleasa Cas, siendo Cas9 la más utilizada. El objetivo genómico especÃfico se determina mediante el método de guÃa de ARN, que forma un complejo con Cas9, permitiendo que la enzima se una al sitio que contiene una complementaridad de bases. En este sitio es donde Cas9 corta el ADN, causando un quiebre de la doble hebra.
La formación de quiebres en la doble hebra puede activar uno de los dos principales mecanismos de reparación del ADN celular: vÃas en la célula: la recombinación no homóloga o unión de extremos no homólogos (NHEJ) o el de reparación directa por homologÃa (HDR). La vÃa de NHEJ repara una rotura añadiendo o eliminando nucleótidos al azar, lo que resulta en cambios en la secuencia de ADN, por lo que no es adecuado para fines de corrección génica. Por lo tanto, los enfoques se centran en la HDR, que utiliza secuencias homólogas (complementarias) para reparar las roturas de ADN, lo que hace posible introducir secuencias especÃficas para permitir reparación a medida.
Una entrega oportuna de los componentes CRISPR en un punto apropiado en el ciclo de división de la célula ya sea en la transición entre G1 y S, o en la transición entre G2 y la fases mitótica, puede conducir a un uso preferencial del camino HDR. Desafortunadamente, en trabajos anteriores la eficiencia de la reparación de HDR después de la acción de CRISPR-Cas9 ha sido indeseablemente baja tanto en cultivo de células madre de embriones humanos (eficiencia de aproximadamente del 2%) como en  embriones humanos (14,3 - 25% de eficiencia).
Hong Ma y colegas diseñaron constructos de  CRISPR-Cas9 para la edición de MYBPC3, y verificaron la unión al gen usando células madre humanas. Posteriormente empezaron a trabajarcon embriones humanos. Uno de los principales retos de usar CRISPR-Cas9 para editar estos genomas ha sido el fenómeno de mosaicismo, en el que las ineficiencias en la edición de genes resulta en embriones que contienen células modificadas y no modificadas (figura 1a). Esto puede llevar a una mezcla de células sanas y enfermas en varios tejidos y órganos, posiblemente causando sÃntomas patológicos.
Figura 1. La edición génica en embriones.
a, El sistema de edición génica, CRISPR-Cas, puede reparar una mutación en un gen. En tres estudios previos publicados utilizando esta técnica en embriones humanos cultivados in vitro, un óvulo (ovocito) fue fecundado y luego se inyectaron los componentes de edición en la célula. Estos incluyen la enzima Cas9 y una guÃa de secuencia de ARN que ayuda a dirigir la maquinaria de modificación hacia una localización especÃfica del genoma, por ejemplo para reparar una mutación heredada del padre. Sin embargo, la edición es a menudo ineficaz, y los embriones en la etapa posterior pueden contener una mezcla de células reparadas y no reparadas - un fenómeno conocido como mosaicismo. b, Hong Ma y colaboradores (Nature. 2017 Aug 24;548(7668):413-419) asumieron un enfoque alternativo para corregir una mutación en el gen MYBPC3 (que está asociado con la enfermedad cardÃaca) en embriones humanos cultivados in vitro. Inyectaron componentes de edición génica y espermatozoides en ovocitos que contenÃan versiones no mutadas de MYBPC3. La mitad de los espermatozoides utilizados tenÃan una mutación MYBPC3. Los ovocitos fueron inyectados en metafase II, una fase de su ciclo celular. Los investigadores reportaron que 42 de los 58 embriones examinados (72,4%) no tenÃan el MYBPC3 mutante, y su análisis sugiere que la copia materna del gen se utiliza como modelo para guiar la reparación. Este enfoque dio lugar a una edición de genes eficiente y uniforme en los embriones, que progresó hasta llegar a una fase posterior del desarrollo embrionario.
Los autores investigaron una situación en la que el padre tenÃa una copia mutante de MYBPC3 y la madre sólo tenÃa copias silvestres del gen. En los experimentos control, el 47,4% (9 de 19) de embriones fecundados in vitro no heredaron la copia mutante de MYBPC3, la proporción esperada dado que la mitad de los espermatozoides deberÃa tener la copia silvestre del gen. Los autores demostraron que, si los componentes de la edición eran inyectados juntos con los espermatozoides en un óvulo humano (ovocito) en una etapa en el ciclo celular como metafase II (figura 1b), un 72,4% de los embriones resultantes (42 de 58) heredaban solamente la versión silvestre de MYBPC3. Los otros 16 embriones tenÃan copias de MYBPC3 con signos de edición mediada por NHEJ que se dirigÃa a la versión mutante del gen pero que no lo reparaba a la versión normal. Â
Curiosamente, cuando los autores analizaron la corrección de MYBPC3 en los embriones, encontraron que sólo uno de los 42 embriones que tenÃan tipo MYBPC3 silvestre habÃa utilizado el método CRISPR para su reparación. Sus resultados indican que la copia materna silvestre de MYBPC3 probablemente otorgó la plantilla de reparación, en lugar de la copia introducida. Esto contrasta con las observaciones en células madre, en las que se utilizó la plantilla de nucleótidos introducida por los investigadores para el proceso de reparación. Los autores proponen que el mecanismo de reparación del ADN que opera en un embrión temprano difiere de aquel que ocurre en células madre. En el embrión en el que se pudo detectar la corrección utilizando la plantilla de reparación, la secuencia de templado se encontró solo en un subconjunto de células, mientras que las restantes probablemente se habÃan corregido usando la versión materna de este gen.
Aunque los autores demostraron que se mantiene la integridad del genoma embrionario después de que la edición por CRISPR-Cas9, lo que es algo sumamente prometedor, se deben realizar más estudios y optimizaciones a esta tecnologÃa. Estos tendrán que confirmar que el enfoque es seguro en términos de criterios como el mosaicismo, edición fuera de objetivo, y detección de anomalÃas en la edición de embriones, todo antes que pueda ser utilizado como terapia para enfermedades hereditarias. Sin embargo, este estudio pavimenta el camino para que las investigaciones con CRISPR-Cas9 lleguen a la clÃnica a futuro. Hasta entonces, las pruebas genéticas embrionarias durante la FIV siguen siendo el método estándar para prevenir la transmisión de enfermedades hereditarias.
Fuente bibliográfica
Biotechnology: At the heart of gene edits in human embryos.
Nerges Winblad and Fredrik Lanner
Department of Clinical Science, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden.
doi:10.1038/nature23533