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Retrovirus inactivados

El xenotrasplante utilizando células, tejidos u órganos de cerdos puede ser la mejor manera de  aliviar la creciente carga impuesta por la falta de donación de órganos. Los cerdos son fisiológicamente similares a los humanos, son fáciles de manipular genéticamente, y tienen un gran número de progenie y un tiempo de reproducción relativamente corto. En contraposición a estas ventajas, los riesgos son el rechazo inmunológico de un órgano xenobiótico, incompatibilidad fisiológica, y la transmisión de microorganismos porcinos. Sin embargo, el campo de xenotrasplante ha visto un considerable avance en los últimos años. Se han llevado a cabo exitosamente dos ensayos clínicos en los que las células de los islotes de cerdo fueron trasplantadas para tratar diabetes. Afortunadamente, en estos ensayos no se evidenció una transmisión de  microorganismos porcinos.

No obstante, bacterias, virus y otros microorganismos también podrían ser transmitidos por el animal donante. El análisis del viroma (la población total de virus en el cerdo) ha revelado la presencia de cientos de virus. Actualmente, se sabe que después de un alotrasplante (trasplante de órganos de humanos a otros humanos), puede ocurrir la transmisión de patógenos como el virus de inmunodeficiencia humana, citomegalovirus, e incluso el virus de la rabia. Pero, se desconoce si los virus porcinos tienen la capacidad de infectar células humanas y provocar enfermedades en el receptor durante el xenotrasplante.

Sin embargo, se ha demostrado que varios virus porcinos, como el virus de la influenza, el virus de Nipah, virus Menangle y el de la hepatitis E (VHE), inducen enfermedades en humanos. Afortunadamente, los métodos establecidos pueden producir animales donantes que estén libres de la mayoría de los virus. Éstos incluyen transferencia de embriones, cesárea, desviación de calostro, vacunación, medicamentos antivirales y aislamiento. Pese a lo anterior, estas precauciones hacen poco para disminuir el riesgo de la transmisión placentaria del VHE y no tienen ningún efecto en los retrovirus endógenos porcinos (PERV).

Los ERV son el resultado de una infección antigua por un retrovirus en los ovocitos o espermatozoides. Los retrovirus crean una copia de ADN de su genoma del ARN (utilizando la enzima viral transcriptasa reversa) e insertarlo en el su genoma celular en el hospedero mediante la enzima integrasa. Si esto ocurre en un óvulo o espermatozoide involucrado en la generación de progenie, el provirus, como otros genes, estarán presentes en el genoma de todas las células de y puede transmitirse a sus descendientes. 

El número de PERV integrados en diferentes variedades de porcino van desde 3 a 140 copias, y hay pruebas de que algunos se están replicando y recombinando activamente. Los aislados virales PERV-A y PERV-B están presentes en todos los cerdos; PERV-C está presente en la mayoría pero no todos. Mientras que PERV-A y PERV-B son capaces de infectar las células humanas, PERV-C sólo puede infectar a las células porcinas. Sin embargo, los recombinantes de PERV-A y PERV-C conservan la capacidad de infectar células humanas y se caracterizan por una mayor tasa de replicación que PERV-A. La única manera de desactivar los PERV es editando el genoma. Los intentos iniciales, con el uso de una nucleasa con dedos de zinc, han sido fallidos: los cortes múltiples en el genoma tenían un efecto citotóxico. Sin embargo, Yang y sus colegas (Science. 2015 Nov 27;350(6264):1101-4) usando la tecnología CRISPR-Cas, lograron desactivar 62 secuencias de PERV en una línea celular porcina inmortalizada. Actualmente, Niu y sus colaboradores (Science. 2017 Sep 22;357(6357):1303-1307) han tenido éxito en generaro lechones vivos y sanos en los que la se han desactivado PERV de manera exitosa (figura 1).

Figura 1. Hacia el Xenotrasplante - Edición del Genoma del Cerdo.

Niu y sus colegas, recientemente reportaron la generación de cerdos en los cuales todos los retrovirus endógenos porcinos (PERV) habían sido inactivados. Usando un método llamado CRISPR-Cas, inactivaron el gen de la polimerasa viral previniendo así la liberación de virus infecciosos. Luego transfirieron los núcleos de estas células tratadas, hacia ovocitos de cerdo, dando lugar a embriones que luego fueron transferidos a cerdas madres de alquiler. Este proceso dio lugar al nacimiento de lechones sanos con PERV inactivados.

Los autores editaron los genomas de fibroblastos primarios fetales de cerdo que normalmente portan 25 secuencias PERV. Esto lo realizaron utilizando un complejo CRISPR-Cas que se dirige a una secuencia en el gen de la polimerasa PERV que codifica la transcriptasa reversa. Por lo tanto, se desactivaron todas las secuencias PERV. Luego se trasladaron los núcleos de estas células en ovocitos de cerdo enucleados (un proceso llamado clonamiento transferencia nuclear de células somáticas)  y se transfirieron los embriones resultantes a las cerdas sustitutas. Aunque la eficiencia de preñez fue un poco más baja que en el caso de los embriones silvestres que no habían sido tratados con el CRISPR-Cas, se logró producir 37 lechones con PERV inactivados a partir de 17 cerdas tras el trasplante de 200 a 300 embriones por animal. Un total de 15 lechones sobrevivieron, y alcanzaron la edad de 4 meses en el momento de la publicación.

Si el hallazgo de que los PERV pueden infectar a células humanas in vitro se traduce a la infección de seres humanos y si pueden inducir enfermedades características de los retrovirus (por ejemplo, inmunodeficiencia y el cáncer), el enfoque demostrado por los equipos de Yang y Niu podrían reducir el riesgo de PERV tras el xenotrasplante a cero. Sin embargo, sigue habiendo obstáculos en el camino hacia el xenotrasplante como procedimiento médico de rutina. Primero, los cerdos con PERV inactivados pueden albergar otros virus como el VHE, el citomegalovirus porcino, y circovirus porcinos, por nombrar algunos. El VHE se ha transmitido de cerdos a seres humanos y puede inducir enfermedades, y el citomegalovirus porcino se ha demostrado que disminuye  sustancialmente el tiempo de supervivencia de los riñones de cerdo en primates. Segundo, serán necesarias modificaciones genéticas adicionales para ayudar a prevenir el rechazo inmunológico del trasplante, particularmente el rechazo hiperagudo que es la causa distintiva del rechazo del xenotrasplante.