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09 Enero 2017

Destino celular en salud y enfermedad

Los sistemas multicelulares se desarrollan a partir de células individuales provenientes de diferentes linajes. Sin embargo, los enfoques actuales de rastreo de linaje profundizan escasamente a nivel de organismos completos. Recientemente, la técnica de edición genómica ha permitido introducir y acumular diversas mutaciones, estableciendo un código de barras en el ADN a lo largo de múltiples rondas de división celular. Este marcaje permite la elucidación de las relaciones de linaje a través de los patrones de mutaciones compartidas entre las células. Tanto en modelos in vitro y animales como pez cebra -que es ampliamente usado para estudios genéticos- se evidencia que la mayoría de las células en los órganos adultos derivan de relativamente pocos progenitores embrionarios. Próximamente, mediante estos análisis de edición del genoma se podrán generar mapas a gran escala sobre el linaje celular en sistemas multicelulares para el estudio de condiciones patológicas y normales del desarrollo, lo que seguramente tendrá una profunda implicancia diagnóstica y terapéutica en pacientes que sufren trastornos genéticos.


Mutaciones genéticas

La variación genética tanto en la salud y en la enfermedad puede surgir a través de la herencia de variantes genéticas de la línea germinal. Tales cambios constituyen la base de los rasgos genéticos heredados. Actualmente, es cada vez más reconocido que las modificaciones en el ADN surgen de manera espontánea durante el desarrollo embrionario, lo que conduce a que un organismo porte en cada una de sus células la variante genética, evento que puede a su vez tienen efectos generalizados. Las modificaciones que ocuren tempranamente durante el desarrollo post cigótico puede resultar en una alteración conocida como mosaico, que puede afectar a la mayoría, pero no a todos, los órganos. Cuando surgen variantes más tardíamente en el desarrollo, pueden encontrarse en unos pocos órganos o incluso en una parte de éstos, una consecuencia del linaje restringido de células afectadas (figura 1).

La mutación genética es un mecanismo comúnmente aceptado para estados patológicos tales como el cáncer y los trastornos del desarrollo, pero también pueden tener un rol en el desarrollo normal de un individuo. Los eventos mutacionales que no son corregidos por la maquinaria de reparación del ADN -como las variantes de un solo nucleótido, deleciones y duplicaciones cromosomales- por lo general no tienen un efecto sobre la supervivencia de la célula portadora de tal cambio. Estas células se multiplican y se diferencian a través de un programa de destinación celular al igual que las otras poblaciones de células. El organismo resultante contiene mezclas de clones de células portadoras de mutaciones con cada población celular con patrones característicos que reflejan su origen desde un progenitor común.

El rastreo del linaje, en el cual los orígenes de las poblaciones celulares están determinados, contribuye a la comprensión básica del proceso normal de desarrollo que, al ser interrumpido, puede dar lugar a enfermedades. Los linajes celulares pueden ser rastreados analizando hacia atrás los estados patológicos para entender qué células son las que han sufrido mutaciones. La capacidad de estudio del papel de las mutaciones en la enfermedad, particularmente la de la mutación post cigótica, se destaca tempranamente en el cáncer, en los que el tejido anormal puede ser comparado con el tejido normal para detectar anormalidades genéticas que conducen a la formación tumoral. Más allá del reino del cáncer, las mutaciones post cigóticas pueden surgir durante el desarrollo y pueden resultar en trastornos del desarrollo neurológico. Por ejemplo, displasia cortical focal, causa común de epilepsia, se ha vinculado  con las mutaciones post cigóticas descubiertas comparando el ADN de tejido cerebral resecado de pacientes con epilepsia intratable con el material genético de tejido no cerebral (por ejemplo el de leucocitos). Recientemente, las técnicas de secuenciamiento de célula única han facilitado la detección de mutaciones post cigóticas (por ejemplo, mutaciones y reordenamientos estructurales) que ocurren durante el desarrollo (figura. 1).

Figura 1: Efecto de las mutaciones, una cuestión de tiempo.

Se muestra el efecto del momento de la mutación postzigótica y su influencia sobre el cerebro. Cada panel muestra las primeras divisiones celulares desde el cigoto de una sola célula (en la parte superior de cada panel). El panel A muestra una mutación (en color rosado) que surge tempranamente en el desarrollo postzigótico y resulta en el acarreo de la mutación en la mitad de las células del individuo resultante (incluyendo la mitad de las células en el cerebro). Tal mutación sería detectable en una fracción del 25% del alelo, lo cual refleja una mutación heterocigótica en el 50% de las células, no sólo en el tejido cerebral, sino también en células de la piel si la célula en la que se originó la mutación fue un precursor temprano del linaje neuroectodérmico. El panel B muestra la ocurrencia y las secuelas de una mutación en una célula más diferenciada, como un progenitor neuronal-glial, con los resultados restringidos al cerebro -en este caso, un hemisferio. Este es el patrón observado en la hemimegalencefalia malformativa epileptogénica. El panel C muestra una mutación en una célula aún más diferenciada, con los resultados que afectan a un área más restringida del cerebro, como ocurre en la displasia cortical focal. En el cerebro, el porcentaje de células que están afectadas por la mutación en una región restringida, tal como en el panel B o C, puede ser bastante bajo (por ejemplo, 3%), porque el tejido cerebral está formado por células de muchos clones que se entremezclan durante el curso del desarrollo.

Tradicionalmente, el rastreo del linaje, se ha logrado mediante el seguimiento del destino de las células especificadas con el uso de colorantes y otros agentes de marcaje de células progenitoras, las cuales pueden ser seguidas en su desarrollo. El destino de las células individuales puede seguirse en detalle, pero los estudios que abordan esto son limitados en escala. En un estudio reciente, Aaron McKenna y colegas (doi: 10.1126/science.aaf7907) describieron un método de trabajo para entender el linaje celular a gran escala. Utilizando este procedimiento, crearon combinaciones únicas de mutaciones que no alteran la función y que persisten de tal manera que la detección posterior sea posible a nivel de todo el organismo. Emplearon un sistema de cultivo celular y un modelo de pez cebra (Danio rerio), un vertebrado genéticamente manejable que se ha adoptado para los estudios de genes asociados con enfermedades humanas.

Los autores fueron capaces de mapear el destino de cientos a miles de células de pez cebra adulto utilizando una combinación de técnicas de edición genómica (GESTALT, del inglés genome editing of synthetic target arrays for lineage tracing). Específicamente, usaron una técnica de edición llamada repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR -Cas9) método para introducir mutaciones irreversibles en el ADN objetivo. Diseñaron moléculas CRISPR para dirigirlas a múltiples sitios del ADN, sucesivamente, partiendo desde una etapa a nivel de célula individual, de una forma estocástica que imita la acumulación de mutaciones neutrales durante el desarrollo.  Se indujeron combinaciones únicas de mutaciones mediante estas sondas y se detectaron a través de la secuenciación del ADN.

Los autores identificaron fácilmente estas combinaciones únicas de mutaciones, o "códigos de barras", que marcaban a grupos de células con linajes compartidos. La clasificación de las células de un único pez cebra en los mapas de linaje, reveló que las mutaciones que se producen tempranamente en el desarrollo persisten hasta la edad adulta y la mayoría de las células de cualquier órgano representan clones que surgieron de unos pocos progenitores.

El estudio otorga pruebas respecto a la diferenciación de los linajes celulares y la característica clonal presente en la mayoría de los órganos, pero ¿cómo pueden usarse sus técnicas para analizar sistemas de enfermedades? Por supuesto, el método GESTALT puede usarse para modelar las acumulaciones estocásticas de mutaciones genéticas sucesivas asociadasal cáncer, tanto para los esporádicos como los que ocurren con predisposición familiar. El método ayudará en el estudio de tumores que tienen células de origen desconocido al comparar los perfiles de células tumorales con células de origen conocido para determinar el origen embriológico del tumor. La técnica GESTALT también podría aplicarse a la emergente investigación basada en el uso de células madre pluripotentes inducidas derivadas del paciente. Además, se pueden introducir mutaciones genéticas para recapitular enfermedades mediadas por múltiples mutaciones, así como también las llamadas enfermedades monogénicas en las que la expresión puede ser modificada por variantes adicionales en genes relacionados. El elusivo papel de los genes modificadores podría de esta forma ser abordado en parte mediante este método. 

El perfil molecular de los tumores y la secuenciación de nueva en sangre y otros tejidos para el análisis de condiciones no cancerosas - incluyendo exome, genoma y secuenciación profunda de subconjuntos de genes candidatos - se han traducido a la clínica en forma de pruebas de diagnóstico y crecientemente están comenzando a guiar enfoques de tratamiento. GESTALT y otros métodos de rastreo de linajes celulares representan herramientas que pueden llenar las brechas del conocimiento al destapar cómo la enfermedad genética se desarrolla a nivel celular.

Fuente bibliográfica

Tracking the Fate of Cells in Health and Disease

Annapurna Poduri, M.D., M.P.H., and Scott L. Pomeroy, M.D., Ph.D.

Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School, Boston.

DOI: 10.1056/NEJMcibr1612882

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