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28 Agosto 2017

Células madre pluripotentes y las precauciones antes de su uso

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) pueden auto renovarse indefinidamente, lo que las vuelve una fuente atractiva para terapias regenerativas. Este potencial de expansión se ha relacionado con la adquisición de un gran número de variantes que proveen a las células mutadas una ventaja de crecimiento. Sin embargo, no se conocen la naturaleza, extensión y efectos funcionales de otras mutaciones adquiridas en el genoma de las hPSC cultivadas. Recientemente, se secuenciaron genes codificantes de proteínas (exomas) de 140 líneas de células madre embrionarias humanas (hESC). Posteriormente, se aplicaron estrategias informáticas para la identificación de mutaciones que se presentan en un subconjunto de células en cada línea. Aunque por lo general las mutaciones como el mosaicismo fueron raras, se identificaron 5 líneas celulares no relacionadas que portan mutaciones en el gen de P53. Tales anomalías son las más comunes observadas en el cáncer humano. Interesantemente, pero no menos preocupante, se evidenció que la fracción alélica mutante de TP53 se incrementa con el número de pasajes en cultivo bajo condiciones estándar, lo que sugiere que las alteraciones en P53 pueden conferir una ventaja selectiva. Debido a que la adquisición y expansión de mutaciones asociadas al cáncer en las hPSC pueden pasar desapercibidas durante la mayoría de sus aplicaciones clínicas, se sugiere una rigurosa caracterización genética de estas células y sus derivadas previo a su implementación terapéutica.


Mutaciones de P53

Las células madre pluripotentes están entrando en ensayos clínicos de fase 1 y 2 para un amplio rango de aplicaciones, que incluyen el tratamiento de la generación macular y otras enfermedades oculares, lesiones de la médula espinal, enfermedades del corazón, diabetes tipo 1 y enfermedad de Parkinson (Nat Rev Mol Cell Biol. 2016 Mar;17(3):194-200). Por necesidad, tanto células madre pluripotentes embrionarias y células madre pluripotentes inducidas (iPSC) necesitan ser expandidas realizando numerosos pasajes en cultivo in vitro porque debido a que comienzan con colonias celulares muy pequeñas derivadas del embrión en fase de blastocisto o a partir de una célula adulta reprogramada. Estas células madre pluripotentes son inmortales y pueden ser expandidas indefinidamente mientras se mantenga la pluripotencia.

La inactivación del gen que codifica la proteína supresora de tumores P53 (TP53) aumenta la eficiencia de la producción de iPSC y su diferenciación mediante la represión de mediadores de senescencia inducidos por P53, lo que resulta en una pérdida selectiva de la función apoptótica y aumenta la transcripción de genes que favorecen la proliferación, como el gen MYC y JUN. Las células de carcinoma embrionario también tienen P53 no funcional.

Por lo tanto, no es sorprendente, aunque si preocupante, que Florian T. Merkle y sus colegas (Nature. 2017 May 11;545(7653):229-233) reportaran recientemente que su secuenciación del exoma de 140 líneas de células madre embrionarias humanas (26 de las cuales fueron producidas para uso clínico) y 117 líneas de iPSC dieran a conocer numerosas mutaciones en TP53. Cinco líneas no relacionadas de células madre embrionarias tenían seis mutaciones inactivantes de TP53 del tipo comúnmente visto en el cáncer.

Además, se encontraron en las iPSC otras nueve mutaciones en TP53 que se prevé pueden generar errores en el dominio de unión al ADN de P53. Las proporciones de células mutadas en TP53 aumentaron con el número de pasajes en cultivo. Al parecer hay una enorme ventaja selectiva para las mutaciones en TP53 que reduce la función de la proteína durante la reprogramación, la expansión de células pluripotentes y durante su diferenciación bajo condiciones in vitro. Merkle y sus colegas no observaron otros errores genéticos recurrentes a través de los exomas de otras células madre pluripotentes que se analizaron. Garitaonandia y colegas (doi: 10.1371/journal.pone.0118307) también han reportado deleciones  recurrentes que afectan TP53 en células madre embrionarias humanas de cultivo. Los investigadores observaron una mutación puntual en el gen supresor de tumor BCOR en una línea iPSC preparada para su uso clínico en Japón, pero la consecuencia de esta mutación respecto a la proliferación celular no está clara proliferación celular no está claro (Yamanaka S, comunicación personal). Durante la expansión in vitro de algunas de estas líneas de iPSC, se observó un aumento marcado de la prevalencia de variantes BCOR.

Figura 1. Detección de deleciones o mutaciones en el locus TP53.

Las deleciones o mutaciones en TP53 (que codifica la proteína P53) necesitan ser detectadas después de la formación inicial de colonias de células madre embrionarias humanas o tras la formación de colonias de células madre pluripotentes inducidas in vitro. Las mutaciones y deleciones también pueden ocurrir durante pasajes en cultivo celular por estrés celular. Por ventaja competitiva, tales incrementarán la fracción alélica mutante en la población de células durante los sucesivos pasajes. El cribado riguroso es capaz de confirmar la ausencia de mutaciones en TP53 tras la expansión celular in vitro y después de la diferenciación en el tipo de célula deseado para la terapia. La ausencia de mutaciones en TP53 y de alteraciones en la proteína que codifica es crítico para las células pluripotentes de aplicación clínica. GMP denota buenas prácticas de fabricación.

Aunque a la fecha no hay reportes de cáncer asociado a TP53 o BCOR en pacientes que han sido tratados con células derivadas de iPCS, sería prudente revisar tales células en varias etapas de su desarrollo y su producción (figura 1). Las mutaciones de TP53 son dominantes negativas, a menudo se fijan en líneas celulares (frecuencia alélica del 50%) y podrían predisponer a las células a sufrir oncogénesis después del trasplante (una mutación dominante negativa resulta en una proteína mutante que no sólo es funcionalmente defectuosa, sino que también interfiere con la función de la proteína normal codificada por el alelo no mutado). Sobre la base de estas observaciones, el análisis cuidadoso de estas colonias primarias de células madre pluripotentes en el momento de su establecimiento ayudaría a eliminar este riesgo. También será necesario evaluar las variantes genéticas durante la expansión en los sucesivos pasajes in vitro y nuevamente después de la diferenciación, o antes del trasplante.

Aunque tales pruebas seriadas podrían ser consideradas costosas, la identificación de líneas de células mutantes y potencialmente peligrosas durante los pasajes de expansión ahorraría el coste de la producción de estas líneas celulares aberrantes. La detección apropiada de secuencias genómicas está disponible para TP53 y otros oncogenes. Tal cribado se debería incorporar en la caracterización de control de calidad del producto antes de que las células sean trasplantadas en pacientes - una recomendación que debiese ser de interés para todos los que tienen la tarea de aprobar los ensayos clínicos con células madre.

Fuente bibliográfica

Potential Pitfall of Pluripotent Stem Cells

Alan Trounson, Ph.D.

Cancer Research Centre, Hudson Institute of Medical Research, and Monash University, Clayton, VIC, Australia.

DOI: 10.1056/NEJMcibr1706906


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